Mikroskopie
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[edit] Konfokale Mikroskopie
In einem "normalen" Lichtmikroskop ist das Bild eine Überlagerung aus einer scharfen Abbildung der Punkte im Fokus und einer unscharfen Abbildung der Punkte außerhalb.
In einem Konfokalmikroskop dagegen passiert das vom Präparat ausgehende Licht (reflektiertes, transmittiertes oder auch Fluoreszenzlicht) eine Lochblende oder einen schmalen Schlitz (vor dem Aufnehmer).
Dadurch wird das Licht von außerhalb der Fokusebene ausgeblendet und erreicht nicht den Detektor (meist ein Photomultiplier oder ein CCD-Chip). Das Ergebnis ist eine deutliche Reduzierung des Streulichts. Die effektive Auflösung ist dadurch auch ohne Zunahme der Vergrößerung viel höher als in einem herkömmlichen Lichtmikroskop.
http://www.olympusconfocal.com/theory/confocalintro.html
Im Unterschied zum konventionellen Mikroskop erzeugt das konfokale Mikroskop also zunächst nur einen Bildpunkt, der allerdings genau einen Punkt aus der Brennebene des Objektivs darstellt. Um eine vollständiges Bild des Objekts zu erhalten, muß das Objekt Punkt für Punkt gerastert (gescannt) werden. Bei der hier gezeigten Anordnung geschieht das dadurch, daß das Objekt jeweils eine kleine Strecke verschoben wird, bevor der nächste Punkt vom Photomultiplier registriert wird ("stage scanning"). Die dabei gesammelten Bildpunkte werden dann von einem Rechner zu einem vollständigen Bild zusammengesetzt.
[edit] CLSM (confocal laser scanning microscope)
Bei diesen wird ein Laserstrahl sehr schnell zeilenweise in einer Objektebene gerastert. Das Licht aus dem Laserfokus wird auf eine kleine Lochblende (engl. pinhole) abgebildet, hinter der sich ein lichtempfindlicher Empfänger befindet. Aus dem Empfängersignal wird dann zeilenweise im Computer ein (Schnitt-)Bild zusammengesetzt.
[edit] Fluoreszenz
Fluoreszenz wird meist optisch angeregt, also indem mit einer geeigneten Lichtquelle beleuchtet wird. Der Fluorophor wird dann durch Absorption eines Photons elektronisch angeregt und emittiert die Anregungsenergie zeitversetzt in Form eines anderen Photons. Energieerhaltung bewirkt, dass das emittierte Photon die gleiche oder eine niedrigere Energie haben muss als das absorbierte Photon. Daraus ergibt sich unmittelbar die Stokessche Regel, dass das Fluoreszenzlicht eine Wellenlänge haben muss, die mindestens ebenso groß ist wie die des Anregungslichtes.
[edit] Stokes Verschiebung
Stokes shift is the difference (in wavelength or frequency units) between positions of the band maxima of the absorption and luminescence spectra of the same electronic transition.
When a molecule or atom absorbs light, it enters an excited electronic state. The Stokes shift occurs because the molecule loses a small amount of the absorbed energy before re-releasing the rest of the energy as luminescence. This energy is often lost as thermal energy.
Emission ist langwelliger als Absorption.
