ELISA

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Enzyme-linked Immunosorbent Assay ist ein immunologisches Nachweisverfahren, welches auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert.

Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezieller spezifischer Antikörper zu Nutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Die Antikörper oder teilweise auch das Antigen werden zuvor mit einem bestimmten Enzym markiert. Die von dem Enzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens.

[edit] Ablauf

• Zwei Antikörper (Ak), die beide hoch spezifisch an das nachzuweisende Antigen binden.

Hierbei ist es wichtig, dass die beiden Aks an leicht unterschiedlicher Stelle an das Antigen binden, da sie sich sonst gegenseitig behindern.

• Der erste Antiköper (coating Antikörper) wird an eine feste Phase (meist spezielle 96-Well Mikrotiterplatte) gebunden. Die Probe mit dem nachzuweisenden Antigen wird dann in die wells gegeben und eine Zeit lang inkubiert.

Während dieser Zeit fischt der an die Platte gebundene Antikörper das Antigen aus der Probe. Nach dieser Inkubationsphase wird die Platte gewaschen was die ungebundenen Bestandteile der Probe entfernt und zurück bleibt nur das an den ersten (coating) Antikörper gebundene Antigen. Im nächsten Schritt wird dann ein Detektions-(detection)Antikörper zugegeben der an seinem Ende ein Enzym (meistens Meerrettichperoxidase (HRP) oder Alkalische Phosphatase (AP)) gebunden hat. Dieser zweite (detection) Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen und es entsteht ein Antiköper-Antigen-Antiköper Komplex (deshalb der Name Sandwich ELISA - das Antigen ist zwischen die beiden Antiköper wie in einem Sandwich gepackt)). Durch erneutes Waschen der Platte wird überschüssiger zweiter Antiköper weggewaschen und dann ein Farbsubstrat (z.B. para-nitro Phenyl-Phosphat (pNPP)) zugegeben. Im Falle von pNPP verwandelt das Enzym (z.B. AP) das zunächst farblose Substrat in ein gelbes Substrat. Die Stärke dieser Farbreaktion ist mittels eines Photometers messbar und ihre Intensität ist proportional zur Antigen Konzentration in der Probe. Bei höheren Konzentrationen in der Probe, oder bei längeren Zeiten der Farbreaktion entsteht eine sigmoidale Kurve, weil das Substrat der Farbreaktion zum größten Teil umgesetzt wird. Um die Konzentration des Antigens in der Probe quantitativ zu bestimmen wird neben der unbekannten Probe auch die Farbintensitaet in mehrerer Standardproben mit bekannter Konzentration des Antigens bestimmt und man erhält eine Standardkurve.